İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler

İnsan iPSC’lerinin hücre akıbetini kontrol etmek için kullanılan geniş bir hücre kültürü ortamı koleksiyonu, takviyeleri, biyoaktif küçük moleküller ve büyüme faktörleri sunuyoruz. Aşağıdaki tablo, insan iPSC’lerini farklı hücre soylarına ayırmak için kullanılan en.

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (İPKH) hikayesi yaklaşık 60 yıl önce Philadelphia’dan Briggs ve King ile Cambridge’den Gurdon isimli araştırmacıların, kurbağa yavrusu barsak hücre çekirdeklerini, çekirdeği çıkarılmış kurbağa yumurtalarına transplante etmeleri ile başlamıştır (85).

Transplante edilen yumurtalar donör nükleusları ile genetik olarak aynı kurbağa yavrularını oluşturmuştur. Bu çalışma, alıcı yumurta sitoplazmasının transplante edilen çekirdeği bir şekilde sağlıklı erişkin kurbağaya çevirebilecek potansiyeli sağladığı gerçeğini ortaya çıkarmıştır. “Somatik hücre nükleer transferi” (Somatic cell nuclear transfer) adı verilen bu deney 1990’lı yıllarda memeli türlerinde de denenmiş ve meşhur koyun Dolly’nin klonlanmasını sağlamıştır (86). 2006 yılında ise, Takahashi ve Yamanaka embriyonel kök hücrelerin (EKH) pluripotensi ve kendini yenileme özelliğini sağlayan 24 faktör üzerinde çalışma yapmışlardır. Oct4 (Octamer 3/4), Sox2 (SRY box-containing gene 2), Klf4 (Kruppel-like factor 4) ve c-Myc kombinasyonunun retrovirüs aracılığı ile eksprese edilmesinin fare fibroblast hücrelerini yeniden programlamak için yeterli olduğunu göstermişlerdir ve bu hücrelere İPKH adı verilmiştir (87). Akabinde, belirtilen kombinasyondaki faktörlerin aynı yöntemle insan fibroblast hücrelerini de yeniden programladığını rapor etmişlerdir (88). Aynı zamanda başka gruplar da, Oct4, Sox2, Nanog ve LIN28A’dan oluşan farklı kombinasyonlarla İPKH’ler elde etmişlerdir (89,90). Bu dönüm noktası çalışmaları nedeniyle Shinya Yamanaka ve Sir John Bertrand Gurdon’a, 2012 yılında Fizyoloji ve Tıp alanında Nobel Ödülü verilmiştir.

Pluripotent özellik nedir?

Pluripotent Kök Hücre Özellikleri

  • Kendisini yineleme ve sürdürme
  • Artma
  • Farklılaşmış dokulara ait hücreleri oluşturabilme
  • Hasar gören dokuyu onarabilme olarak sıralanır.

Kök hücreler farklılaşma potansiyellerine göre unipotent, multipotent, pluripotent ve totipotent olarak gruplandırılırlar [32,33]. Unipotent kök hücreler bir tek farklılaşmış hücre tipini oluşturabilirler. Totipotent kök hücreler tüm embriyonik dokulardaki özelleşmiş hücrelerle birlikte plasenta gibi ekstraembriyonik dokulara farklılaşarak tam bir organizmayı oluşturabilirler [34]. Multipotent kök hücreler ise genelde kendileriyle aynı embriyonik tabakayı temsil eden, sınırlı sayıda hücre tipine farklılaşabilme potansiyeline sahiptirler [32]. Pluripotent özellik üç embriyonik tabakayı (endoderm, mezoderm, ektoderm) temsil eden hücre tiplerine farklılaşabilme özelliği olarak tanımlanabilir. Embriyonik kök hücreler pluripotent olmalarının yanında sınırsız çoğalma ve kendi kendilerini yenileyebilme özellikleri ile birçok hastalığın tedavisinde kullanılabilecek somatik hücre stoğunu üretmekte kullanılabilirler [1]. Embriyonun blastosist evresindeki iç hücre kitlesinden elde edilen embriyonik kök hücreler endoderm, ektoderm ve mezodermi temsil eden hücre tiplerine farklılaşabilir ve hepatositler, sinir hücreleri, kalp kası hücreleri gibi terminal farklılaşmasını tamamlamış hücre tiplerini oluşturabilirler.

İnsan embryonik kök hücre üretimi fertilizasyon sonrası embriyonun farklı aşamalarından yapılabileceği gibi, en yaygın kullanılan yöntem blastosistevresindeki iç hücre kitlesinin izolasyonu ve in vitro ekspansiyonudur. iEKH: insan embriyonik kök hücreleri; ICM: ‘inner cell mass-iç hücre kitlesi.

Çekirdek transferi, hücre füzyonu ve transkripsiyon faktörlerinin ektopik ekspresyonlarının sağlandığı araştırmalara kadar, terminal farklılaşmasınıtamamlamış hücrelerin kaderinin değişemeyeceği düşünülmekteydi. Ancak özelleşmiş somatik hücrelerin embriyonik hücrelerin içerdiği tüm genetikbilgiye sahip olduğu ve uygun koşullar sağlandığında (mikroçevre, gen ifadesinin değişimi vb.) embriyonik karakterdeki hücrelere dönüşebilecekleri gösterilmiştir [6,35,36]. İn vitro ve in vivo embriyonik kök hücrelerin pluripotent özelliği Nanog, Sox-2 ve Oct-4 transkripsiyon faktörlerinin eşzamanlı ekspresyonlarına dayanır ancak in vivo embriyonik kök hücrelerin pluripotent özelliği bu hücrelerin kendi kendilerini yenileyememeleri nedeniyle gelişimin ilerleyen aşamalarında kaybolmaktadır [37]. İn vitro embriyonik kök hücrelerin ise besleyici hücrelerle kültüre edildiklerinde pluripotent karakterlerini sınırsız bölünebilme kapasiteleri ile korudukları gösterilmiştir [38]. Normal karyotipini koruyarak kendikendini yenileyebilen embriyonik kök hücrelerin pluripotent özellikleri, in vivo olarak ağır kombine immün yetmezlik sendromu (SCID) gösteren farenin testis kapsülüne enjekte edilmeleri sonrasında, üç germ tabakasnı temsil eden hücreleri içeren teratoma oluşturmaları ile gösterilir [39,40]. İn vitro farklılaşma potansiyeli ise uygun kültür koşullarının (besleyici hücreler, büyüme faktörleri) ortamdan kaldırılması ile embriyonik kök hücrelerin üç boyutlı agregatları yani ‘embrioid cisimcikleri’ oluşturmaları ile gösterilebilir. Embrioid cisimcikler morfolojik olarak,merkezi kavitenin primitif endoderm benzeri hücre katmanıyla çevrelendiği hücre yığınlarına benzerler ve ortalama 21 gün sonrasında endoderm, mezoderm ve ektoderm tabakalarına ait hücre tiplerine özgün moleküler belirteçleri eksprese ederler [41,42]. Embriyonik kök hücrelerin kültür ortamında ve iç hücre kitlesinde epigenetik yönden de farklılık gösterdikleri bilinmektedir. İn vitro pluripotent hücrelerin genomlarında yüksek metilasyon görülürken, embriyogenezde iç hücre kitlesini oluşturan hücrelerde metilasyonun düşük derecede olduğu gösterilmiştir [43].

Pluripotent hücreler fare embriyosunun farklı aşamalarından elde edilebilirler. Epiblast kök hücreleri olarak adlandırılan bu hücre grubu embriyo implantasyonundan sonra (5.5-7.5 günler) iç hücre kitlesinden farklılaşarak epiblastı oluşturan epitelyal hücrelerden elde edilirler. İnsan embriyonikkök hücreleri gibi in vitro kültür ortamında FGF2 (Fibroblast büyüme faktörü 2) ve Aktivin desteğine ihtiyaç duyarlar, pluripotenttirler ve embrioid cisimcik-teratoma oluşumu gösterirler [44]. Her ne kadar pluripotent hücreler olarak değerlendirilseler de sınırlı farklılaşma potansiyelleri vardır, X kromozomu inaktivasyonu gösterirler ve kimerik canlı oluşturmada embriyonik kök hücreler kadar etkin değillerdir [45]. Fare embriyosundaki (8.5 gün) primordial germ hücrelerinin de embriyonik kök hücrelere benzer karakterde olduğu ve in vitro kültür sonrasında teratoma ve kimerik canlı oluşturma potansiyeline sahip olduğu gösterilmiştir [46]. Tüm bu pluripotent hücre tiplerinde, pluripotent özelliğin kontrolü ve devamının sağlanmasında rol alan evrensel bir mekanizmanın var olup olmadığı henüz bilinmemekle birlikte, şimdiye kadar birçok intrinsik ve ekstrinsik faktörün pluripotent özelliği sağlanması için gerekli olduğu tespit edilmiştir.Oct-4 tüm pluripotent hücrelerde eksprese edilen POU (Pit-1, Oct-1, Oct-2, and Unc-86) domaini içeren transkripsiyon faktörüdür ve ekstraembriyonik dokuların oluşması ile ekspresyonunun düştüğü görülmüştür [22,47]. Başlangıçta tüm blastomerlerde görülen ekspresyon, blastosist evresinde iç hücrekitlesindeki hücrelerle sınırlı kalır ve erişkin memeli organizmalarda Oct-4 ekspresyonu yalnızca germ hücrelerinde görülür [48].

Oct-4 ekspresyon kaybı, fare embryolarında gelişimin durmasına, iç hücre kitlesindeki hücrelerin pluripotent özelliklerini kaybetmelerine ve yalnızca trofektodermin gelişmesine neden olur [22]. Oct-4’ün aşırı ekspresyonu ise endodermal ve mezodermal farklılaşma ile sonuçlanır [49]. Sox-2 de, Oct-4 gibi pluripotent özelliğin sağlanması için gereklidir. Sox-2 ekspresyonu oositte başlar, iki hücreli embriyoda görülür, 4 ve 8 hücreli aşamalardan morula evresine kadar ekspresyonu artarak devam eder ve blastosist evresinde iç hücre kitlesinde görülmekle birlikte bazı trofektoderm hücrelerinde de eksprese edildiği bilinmektedir [23,50]. Preimplantasyon fare embriyolarında Sox-2 ekspresyonunun inhibisyonu morula aşamasından öteye geçilememesiyle sonuçlanır [50]. İn vitro Sox-2 inhibisyonu sonucunda ise trofektoderm farklılaşması görülür [51]. Sox-2 ve Oct-4’ün dimer oluşturarak aralarında Nanog’un da olduğu birçok genin ekspresyonunu yönettiği bilinmektedir [52]. Nanog ekspresyonu morula aşamasında başlar, blastosist evresinde iç hücre kitlesindeki hücrelerde görülür ve sonrasında ekspresyonu epiblastla sınırlı kalır [53,54]. Nanog’un aşırı ekspresyonu fare ve insan embriyonik kök hücrelerinde büyüme faktörü eklen mesine gerek kalmadan in vitro pluripotent özelliğin korunması için yeterlidir [54,55]. Buna karşın, Na nog gen delesyonu ile ekstraembriyonik dokulara farklılaşma ve Oct-4, SSEA-4 transkripsiyonlarında azalma görülür.

Mitsui ve ark. (2003) fare embriyonik ve epiblast kök hücrelerinde pluripotent olmayan hücrelere oranla artmış ekspresyonu görülen 20 civarında geni belirlemesiyle başlayan çalışmalar sonrasında Takahashi ve Yamanaka’nın fare fibroblastlarında bu faktörlerin farklı kombinasyonlarını kullanıp somatik hücrelerden indüklenmiş pluripotent kök hücreler elde etmeleriyle, pluripotent özelliğin intrinsik kontrol mekanizmasına ait önemli ipuçları elde edilmiştir. Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc, Lin 28 ve Nanog somatik hücrelerin yeniden programlanmasında kullanılan başlıca transkripsiyon faktörleri olarak belirlense de, özellikle histon modifikasyonlarını değiştiren kimyasal maddelerin ve hücrelerin bulunduğu kültür koşullarının (sitokinler, büyüme faktörleri, serum, besleyici hücreler vb.) da pluripotent özelliğin kazanılması ve korunması için önemli olduğu görülmüştür.

KAYNAK:

1. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. Embryonic  stem  cell  lines  derived  from  human  blastocysts. Science 1998;282:1145-1147.
2. Condic ML, Rao M. Alternative sources of pluripotent stem cells: ethical and scientific issues revisited. Stem Cells Dev 2010;19:1121-1129.
3.  Gurdon  JB,  Melton  DA.  Nuclear  reprogramming  in cells. Science 2008;322:1811-1815.
4. Cowan CA, Atienza J, Melton DA, Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science 2005;309:1369-1373.
5. Wilmut I, Schnieke AE, Mcwhir J, Campbell KHS. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997;385:810-813.
6.  Takahashi  K,  Yamanaka  S.  Induction  of  pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006;126:663-676.
7. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007;131:861-872.
8. Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, et al. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science 2008;322:945-949.
9. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al. Induced pluripotent  stem  cell  lines  derived  from  human  somatic  cells. Science 2007;318:1917-1920.
10. Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, et al. Efficient induction  of  transgene-free  human  pluripotent  stem  cells  using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 2009;85:348-462.
11. Okita K, Hong H, Takahashi K, Yamanaka S. Generation  of  mouse-induced  pluripotent  stem  cells  with  plasmid vectors. Nat Protoc 2010;5:418-428.
12. Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 2009;458:766-770.
13. Osteil P, Tapponnier Y, Markossian S, et al. Induced pluripotent  stem  cells  derived  from  rabbits  exhibit some characteristics of naïve pluripotency. Biol Open 2013;2:613-628.
14. Liu H, Zhu F, Yong J, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell 2008;3:587-590.
15. Jia F, Wilson KD, Sun N, et al. A nonviral minicircle vector  for  deriving  human  iPS  cells.  Nat  Methods 2010;7:197-199.
16.  Huangfu  D,  Osafune  K,  Maehr  R,  et  al.  Induction of  pluripotent  stem  cells  from  primary  human  fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol 2008;26:1269-1275.
17. Kim D, Kim CH, Moon JI, et al. Generation of human induced  pluripotent  stem  cells  by  direct  delivery  of  reprogramming proteins. Cell Stem Cell 2009;4:472-476.
18. Pandian GN, Nakano Y, Sato S, et al. A synthetic small molecule for rapid induction of multiple pluripotency genes in mouse embryonic fibroblasts. Sci Rep 2012;2:544.
19. Zhang Z, Gao Y, Gordon A, et al. Efficient generation of fully reprogrammed human iPS cells via polycistronic retroviral vector and a new cocktail of chemical compounds. PloS One 2011;6:e26592.
20. Li W, Ding S. Small molecules that modulate embryonic  stem  cell  fate  and  somatic  cell  reprogramming.  Trends Pharmacol Sci 2010;31:36-45.
21. Yan X, Qin H, Qu C, et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev 2010;19:469-480.
22. Nichols J, Zevnik B, Anastassiadis K, et al. Formation of  pluripotent  stem  cells  in  the  mammalian  embryo  depends on the POU transcription factor Oct4. Cell 1998;95:379-391.
23. Avilion AA, Nicolis SK, Pevny LH, et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. Genes Dev 2003;17:126-140.
24. Chambers I, Silva J, Colby D, et al. Nanog safeguards pluripotency  and  mediates  germline  development.  Nature 2007;450:1230-1234.
25. Adhikary S, Eilers M. Transcriptional regulation and transformation by Myc proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 2005;6:635-645.
26. Rowland BD, Bernards R, Peeper DS. The KLF4 tumour suppressor is a transcriptional repressor of p53 that acts as a context-dependent oncogene. Nat Cell Biol 2005;7:1074-1082.
27. Li Y, McClintick J, Zhong L, et al. Murine embryonic stem cell differentiation is promoted by SOCS-3 and inhibited by the zinc finger transcription factor Klf4. Blood 2005;105:635-637.
28.  Cartwright  P,  McLean  C,  Sheppard  A,  et  al.  LIF/STAT3 controls ES cell self-renewal and pluripotency  by  a  Myc-dependent  mechanism.  Development 2005;132:885-896.
29. Wernig M, Meissner A, Foreman R, et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 2007;448:318-324.
30. Maherali N, Sridharan R, Xie W, et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell 2007;1:55-70.

Bir cevap yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir

Show Buttons
Hide Buttons