IPSCs Nedir?

Kök Hücre Nedir?

Kök hücre, mitoz bölünmeyle özelleşmiş hücre tiplerine farklılaşabilen ve kendini yenileme yeteneğine sahip olan, bütün çok hücreli canlıların doku ve organlarını oluşturan ana hücre türleridir.

Kendini yenileyebilen kan hücrelerinin varlığı ilk kez 1950’li yıllarda gösterilmiştir olsa da bugün kullandığımız anlamdaki kök hücrenin tanımı 1961 yılında deney hayvanları üzerinde yürütülen çalışmalar üzerinde yapılabilmiştir.

 

Bu haftaki konumuz İndüklenmiş pluripotent kök hücreler, spesifik faktörler yardımıyla uyarılmış somatik hücrelerin pluripotent evreye yeniden programlanması sonucu oluşmaktadırlar. Kullanımlarına ilişkin halihazırda etik sınırlamalar bulunan insan embriyo ve oositlerinden sağlanan embriyonel kök hücrelerin aksine; fibroblast, adiposit, keratinosit ve kan gibi farklı orijinli hücrelerden elde edilebilmektedirler

İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN DOĞUŞU

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (İPCS) hikayesi yaklaşık 60 yıl önce Philadelphia’dan Briggs ve King ile Cambridge’den  İndüklenmiş pluripotent kök hücre, Pluripotensi yeniden programlama  araştırmacıların , kurbağa yavrusu barsak hücre çekirdeklerini çekirdeği çıkarılmış kurbağa yumurtalarına transplante etmeleri ile başlamıştır .

Transplante edilen yumurtalar donör nükleusları ile genetik olarak aynı kurbağa yavrularını oluşturmuştur. Bu çalışma, alıcı yumurta sitoplazmasının transplante edilen çekirdeği bir şekilde sağlıklı erişkin kurbağaya çevirebilecek potansiyeli sağladığı gerçeğini ortaya çıkarmıştır. “Somatik hücre nükleer transferi” (Somatic cell nuclear transfer) adı verilen bu deney 1990’lı yıllarda memeli türlerinde de denenmiş ve meşhur koyun Dolly’nin klonlanmasını sağlamıştır . 2006 yılında ise, Takahashi ve Yamanaka embriyonel kök hücrelerin (ECS) pluripotensi ve kendini yenileme özelliğini sağlayan 24 faktör üzerinde çalışma yapmışlardır.

Oct4 (Octamer 3/4), Sox2 (SRY box-containing gene 2), Klf4 (Kruppel-like factor 4) ve c-Myc kombinasyonunun retrovirüs aracılığı ile eksprese edilmesinin fare fibroblast hücrelerini yeniden programlamak için yeterli olduğunu göstermişlerdir ve bu hücrelere İPCS adı verilmiştir . Akabinde, belirtilen kombinasyondaki faktörlerin aynı yöntemle insan fibroblast hücrelerini de yeniden programladığını rapor etmişlerdir . Aynı zamanda başka gruplar da, Oct4, Sox2, Nanog ve LIN28A’dan oluşan farklı kombinasyonlarla İPCS’ler elde etmişlerdir .

Bu dönüm noktası çalışmaları nedeniyle Shinya Yamanaka ve Sir John Bertrand Gurdon’a, 2012 yılında Fizyoloji ve Tıp alanında Nobel Ödülü verilmiştir.

 

 

 EMBRİYONEL KÖK HÜCRE ile İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRENİN KARŞILAŞTIRILMASI

Embriyonel kök hücreler, fare ve insan blastosistlerinden sırasıyla 1981 ve 1998 yıllarında elde edilmelerinden bu yana rejeneratif tıp tedavileri için ümit vaat eden kaynak olmuşlardır. Bunun nedeni ise kültür ortamlarında farklılaşma potansiyellerini ve kendini yenileme özelliklerini korumalarıdır. ECS’ler her üç germ yaprağına (endoderm, mezoderm ve ektoderm) farklılaşabilen pluripotent kök hücrelerdir . İPCS’ler de morfolojileri ve pluripotensi belirteçlerinin ekspresyonu açısından Embriyonel kök hücrelere benzemektedirler ve ciddi kombine immün yetmezlikli (SCID) farelere enjekte edildiklerinde üç embriyonel germ yaprağını içerecek şekilde teratom oluşturmaktadırlar.

Bu da onların pluripotensi özelliklerini doğrulamaktadır. Hücre ve dokulara farklılaşma özellikleri de ECS’ler ile benzerdir . İlk olarak Embriyonel kök hücrelerin izolasyonu, gelişimini tamamladığında yeni bir canlıya dönüşebilecek blastosistin yok edilmesine sebep olduğundan, çeşitli etik ve ahlaki tartışmalara neden olmaktadır. Bu nedenle insan Embriyonel kök hücre araştırma ve kullanımlarına ilişkin düzenlemeler açısından ülkeler arasında farklılıklar bulunmaktadır. İPCS’ler çok farklı orijindeki somatik hücrelerden elde edilebildiğinden ve embriyonik materyal manipülasyonunu gerektirmediğinden kullanımlarına ilişkin etik ve yasal sınırlamalar bulunmamaktadır. ECS’lerin heterolog kaynaklardan elde edilmesi sebebiyle mevcut olan immün rejeksiyon riski tedavi amaçlı kullanımlarındaki önemli sınırlamalarından biri olarak görülmektedir ve bu konu çeşitli araştırmalarda irdelenmiştir . İPCS teknolojisinin fonksiyonel otolog hücrelerin eldesini mümkün kılması sebebiyle, rejeneratif tıp uygulamalarını greft rejeksiyon riski minimalize edilmiş kişiselleştirilmiş tedavi boyutuna çevireceği ön görülmektedir

YENİDEN PROGRAMLAMA: TRANSKRİPSİYON FAKTÖRLERİ ve HÜCREYE AKTARIM YÖNTEMLERİ

Yeniden programlama, farklılaşmanın geriye döndürülerek farklılaşmış hücrelerin tekrar pluripotent hücreler haline dönüştürülme sürecidir. Bu süreç, kromatin yapısının yeniden düzenlenmesiyle birlikte somatik olarak eksprese olan genlerin susturulmasına ve Embriyonel kök hücre genlerinin ifadesinde artışa yol açmaktadır. Yeniden programlamayı anlamak için Embriyonel kök hücrelerdeki Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc’in rolü incelenmelidir. Bu transkripsiyon faktörlerinin tümü erken embriyonik gelişim sürecinde pluripotensinin kurulumunda ve/veya sürdürülmesinde önemlidir.

Transkripsiyon Faktörleri Oct4, Sox2, Klf4; pluripotensi genleri olarak tanımlanan ve ECS’lerde yüksek miktarda eksprese edilen genlerin promotor ve “enhancer” bölgelerini birlikte kullanarak ECS’lerin pluripotensi ve kendini yenileme durumlarının devamını sağlamaktadır. Diğer bir ECS spesifik transkripsiyon faktörü olan Nanog da Oct4 ve Sox2 ile birlikte pluripotensi için gereklidir. Oct4, Sox2 ve Klf4, ECS spesifik transkriptomun upregülasyonunda gerekli fonksiyonel sürecin oluşması için yeniden programlama olayında işbirliği yapmaktadır.

ECS’lerde bu faktörlerin tek başlarına etkileri ise genellikle transkripsiyonel baskılanma şeklindedir. İyi bilinen proto-onkogen ve hücre döngüsü düzenleyicisi olan c-Myc’in ise ECS’lerdeki hedef genleri Oct4, Sox2 ve Klf4’dan büyük ölçüde farklıdır ve ayrı bir transkripsiyonel ağ oluşturmaktadır. c-Myc, İPCS’lerin oluşumunda vazgeçilmez değildir ancak yeniden programlamanın kinetiklerini ve etkinliğini arttırıcı etkisi bulunmaktadır. Somatik hücrelere yeniden programlama faktörlerinin aktarılmasında iyi bir alternatif haline getirmektedir. Bununla birlikte, transpozon ile yapılan yeniden programlamada DNA’nın somatik hücrelere aktarımı için kullanılan yöntemlere (lipofeksiyon, elektroporasyon veya nükleofeksiyon) bağlı olarak sınırlamalar oluşabilmektedir çünkü bazı primer hücrelerde direnç ya da toksisite görülebilmektedir. Ayrıca, transpozisyon reaksiyonu her zaman kesin olmamakta, %5 oranında değişiklikler oluşabilmekte ve buna bağlı olarak da elde edilen İPCS genomunda izler bırakabilmektedir.

Fare ve insan embriyonik fibroblastlarından PB transpozonlar ile İPCS eldesi gösterilmiştir ancak verimlilikleri orta düzeyde olmuştur ve erişkin cilt fibroblastları gibi zor yeniden programlanan hücreler için kullanılabilirlikleri gösterilememiştir. Virüs içermeyen yeniden programlamada kullanılan yöntemlerden biri de transkripsiyon faktörlerini içeren plazmidler ile somatik hücrelerin transfeksiyonudur.

Uygulama kolaylığı ve viral partiküllerin üretimini gerektirmemesi bu yöntemin avantajlarıdır. Ancak bu yöntemle elde edilen yeniden programlama verimliliği virüs tabanlı sistemlere göre oldukça düşüktür. Ayrıca, aktarılan genleri geçici olarak eksprese etmeleri sebebiyle ardışık seri transfeksiyonların yapılmasını gerektirmektedir . Plazmid vektörler memeli hücrelerinde replike olamadıklarından, aktarılan genleri geçici olarak eksprese edebilirler. Ancak oriP/Epstein-Barr nükleer antijen-1 (oriP/EBNA-1) gibi epizomal tabanlı vektörler bölünen ve bölünmeyen hücrelerde genoma entegre olmaksızın ilave kromozomal otonom parçalar olarak replike olmaktadırlar. Bu vektörler ilaç seçiciliği baskısı altında varlıklarını stabil epizomlar olarak devam ettirilebilmektedirler ve ilacın uzaklaştırılmasını müteakiben artan biçimde kaybolmaktadırlar.

Uygulanmaları plazmid vektörlere göre daha kolay olmakla birlikte, yeniden programlama verimlilikleri plazmid vektörler gibi virüs tabanlı yöntemlerden düşüktür . Bakteriyel omurgası çıkarılmış, genoma entegre olmayan ve kendini replike etmeyen vektörler olan “minicircle”lar, plazmid vektörlere göre daha yüksek transfeksiyon verimlilikleri ve daha uzun süreli gen eksprese etme özellikleri sebebiyle İPCS eldesinde kullanılmışlardır. “Minicircle” DNA’ların verimlilikleri virüs tabanlı yöntemlere göre düşük olsa da, kullanımları hali hazırda ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından onaylanmış olduğundan klinik uygulamalar için ümit vaat etmektedir . MikroRNA’lar (miRNA) 21-24 nükleotid uzunluğunda kodlama yapmayan ve gen ekspresyonu üzerine etkileri bulunan küçük RNA molekülleridir. miRNA’lar, mRNA’daki parsiyel komplementer dizilerine bağlanarak ya yıkımlarını arttırırlar ya da translasyonel sessizleştirmeye neden olurlar. Hedef RNA’lardaki bağlanma yerleri sadece 3’ UTR’si (translasyona uğramayan bölge) değildir, kodlayıcı bölgeleri de içeren herhangi bir yere bağlanabilirler. Ayrıca, promotor bölgeleri de hedef alırlar ve uzun kodlanmayan RNA’lara (lncRNA) bağlanırlar, böylelikle fonksiyon kapasitelerini çok fazla arttırırlar. İnsanlarda 2000’nin üzerinde farklı miRNA bulunduğu düşünülmektedir ve birçoğu sekans benzerlikleri nedeniyle aileler olarak yazılmaktadır.

 İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN GENEL ÖZELLİKLERİ VE TEMEL KAVRAMLAR

Belirli miRNA’lar pluripotensiyi düzenleyen genlerin kritik destekleyicisidirler ve ECS’lerde yüksek miktarda eksprese olmaktadırlar. miRNA’lar İPCS eldesinde hem tek başlarına hem de transkripsiyon faktör kombinasyonlarına eklenerek kullanılmışlardır. miRNA’ların üstünlüğü geleneksel transkripsiyon faktörlerinin kombinasyonlarına göre yaklaşık 100 kat daha verimli ve hızlı olmalarıdır. miRNA’lar küçük olmaları, kolay sentezlenebilmeleri, kolay transfekte edilebilmeleri ve nispeten kararlı olmaları sebebiyle somatik hücrelerin yeniden programlanmasında ideal bir yöntem olarak görülmektedir. Ancak etki mekanizmaları halen tam olarak bilinmemektedir. İPCS eldesinde sentetik mRNA’lar ile somatik hücrelerin transfekte edilmesi de denenmiştir. mRNA’ların fonksiyon görmesi için hücre çekirdeğine ulaşmaları gerekmediğinden sadece sitoplazmaya transfeksiyonları yeterlidir ve yeniden programlama verimliliğinin yüksek olmasını sağlamaktadır.

Ancak mRNA’ların ömrünün kısa olması tekrarlayan transfeksiyonları ve yüksek miktarda kullanımlarını gerektirmektedir, bu da iş yükünü ve maliyeti arttırmakta, bunun yanı sıra hücrelerde RNA’ya karşı kazanılmış immün cevap oluşmasına neden olmaktadır . Yeniden programlama faktörleri yerine proteinlerin kullanılması özellikle biyoteknoloji firmaları tarafından insan uygulamaları kapsamında İPCS teknolojisinin ticarileştirilmesi yönünde ilgili çekici bulunmaktadır. Ancak, proteinlerin yarı ömürlerinin kısa olması, yüksek miktarda protein gerekmesi, programlamanın yavaş ve yeterince verimli olmaması sebebiyle bu yöntem üzerinde daha çalışılması gerekmektedir .

Son olarak, yeniden programlamada ümit vaat eden bir diğer yaklaşım; epigenomik yeniden düzenlenme, proliferasyonun artırılması ve epitelyal fenotipin kazanılması gibi altta yatan moleküler mekanizmalar üzerinde etki gösterecek küçük moleküllerin (kimyasal bileşikler) kullanılmasıdır. Küçük moleküllerin, transkripsiyon faktörleri yerine kullanımını ya da programlama sürecinin kinetiğini ve etkinliğini arttırarak yeniden programlamayı kolaylaştırdığını bildiren çok sayıda çalışma bulunmaktadır. Kullanılan küçük moleküllere valproik asit (histon deasetilaz inhibitörü), BIX01294 (histon metil transferaz inhibitörü) ve PD0325901 [MEK (mitogen-activated protein kinase) inhibitörü] örnek olarak verilebilir. Burada unutulmaması gereken husus, bu moleküllerinin çoğunun güçlü DNA ve kromatin düzenleyicileri olduğu ve bu sebeple yeniden programlanmış hücrelerde istenmeyen epigenetik değişikliklere yol açabileceğidir .

Embriyodan Pluripotent Hücre Elde Edilmesi

 

İnsan embryonik kök hücre üretimi fertilizasyon sonrası embriyonun farklı aşamalarından yapılabileceği gibi, en yaygın kullanılan yöntem blastosist evresindeki iç hücre kitlesinin izolasyonu ve in vitro ekspansiyonudur. iECS: insan embriyonik kök hücreleri; ICM: ‘inner cell mass-iç hücre kitlesi.

Çekirdek transferi, hücre füzyonu ve transkripsiyon faktörlerinin ektopik ekspresyonlarının sağlandığı araştırmalara kadar, terminal farklılaşmasını tamamlamış hücrelerin kaderinin değişemeyeceği düşünülmekteydi. Ancak özelleşmiş somatik hücrelerin embriyonik hücrelerin içerdiği tüm genetik bilgiye sahip olduğu ve uygun koşullar sağlandığında (mikroçevre, gen ifadesinin değişimi vb.) embriyonik karakterdeki hücrelere dönüşebilecekleri gösterilmiştir. İn vitro ve in vivo embriyonik kök hücrelerin pluripotent özelliği Nanog, Sox-2 ve Oct-4 transkripsiyon faktörlerinin eşzamanlı ekspresyonlarına dayanır ancak in vivo embriyonik kök hücrelerin pluripotent özelliği bu hücrelerin kendi kendilerini yenileyememeleri nedeniyle gelişimin ilerleyen aşamalarında kaybolmaktadır. İn vitro embriyonik kök hücrelerin ise besleyici hücrelerle kültüre edildiklerinde pluripotent karakterlerini sınırsız bölünebilme kapasiteleri ile korudukları gösterilmiştir. Normal karyotipini koruyarak kendi kendini yenileyebilen embriyonik kök hücrelerin pluripotent özellikleri, in vivo olarak ağır kombine immün yetmezlik sendromu (SCID) gösteren farenin testis kapsülüne enjekte edilmeleri sonrasında, üç germ tabakasnı temsil eden hücreleri içeren teratoma oluşturmaları ile gösterilir.

İn vitro farklılaşma potansiyeli ise uygun kültür koşullarının (besleyici hücreler, büyüme faktörleri) ortamdan kaldırılması ile embriyonik kök hücrelerin üç boyutlı agregatları yani ‘embrioid cisimcikleri’ oluşturmaları ile gösterilebilir.

Embrioid cisimcikler morfolojik olarak ,merkezi kavitenin primitif endoderm benzeri hücre katmanıyla çevrelendiği hücre yığınlarına benzerler ve ortalama 21 gün sonrasında endoderm, mezoderm ve ektoderm tabakalarına ait hücre tiplerine özgün moleküler belirteçleri eksprese ederler. Embriyonik kök hücrelerin kültür ortamında ve iç hücre kitlesinde epigenetik yönden de farklılık gösterdikleri bilinmektedir. İn vitro pluripotent hücrelerin genomlarında yüksek metilasyon görülürken, embriyogenezde iç hücre kitlesini oluşturan hücrelerde metilasyonun düşük derecede olduğu gösterilmiştir.

 

Bir cevap yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir